Основательница обители - великая княгиня Елизавета Фёдоровна. В 1905 году в Кремле был убит ее муж, великмй князь Сергей Александрович, московский генерал-губернатор.
В 1909 году она продала свои драгоценности, и на вырученные деньги купила на Большой Ордынке усадьбу с четырьмя домами и обширным садом, где и расположилась Марфо-Мариинская Обитель Милосердия (монастырь с сочетанием благотворительной и медицинской работы). Соборный храм обители, Покровский собор, был спроектирован Алексеем Щусевым, совместно с Б. В. Фрейденбергом и Л. В. Стеженским.
По плану Елизаветы Фёдоровны, обитель должна была оказывать комплексную, духовно-просветительскую и медицинскую помощь нуждающимся, которым часто не просто давали еду и одежду, но помогали в трудоустройстве, устраивали в больницы. Нередко сестры уговаривали семьи, которые не могли дать детям нормальное воспитание (например, профессиональные нищие, пьяницы и т. д.), отдать детей в приют, где им давали образование, хороший уход и профессию.
В обители были созданы больница, отличная амбулатория, аптека, где часть лекарств выдавалась бесплатно, приют, бесплатная столовая и еще множество учреждений. В Покровском храме обители проходили просветительские лекции и беседы, заседания Императорского Православного Палестинского общества, Географического общества, духовные чтения и другие мероприятия.
В апреле 1918 года Елизавета Фёдоровна была арестована. Обитель продолжила свою деятельность до 1926 года, а затем в её помещениях два года действовала поликлиника в которой работали сёстры под руководством княжны Голициной. После ареста княжны часть сестёр была выслана в Туркестан, другие переселились в Тверскую область, где создали огородное хозяйство под руководством о. Митрофана Сребрянского.
После закрытия обители в её соборном храме (Покровский собор) был кинотеатр, позднее дом санитарного просвещения. В Марфо-Мариинской церкви разместилась амбулатория им. профессора Ф. Рейна. После Великой Отечественной войны здание Покровского храма передали под Государственные реставрационные мастерские (позднее — Художественно-реставрационный центр им. И. Э. Грабаря).
В 1992 году постановлением правительства Москвы комплекс Марфо-Мариинской обители был передан Московской Патриархии. Главный Покровский храм был возвращён церкви Центром имени И. Э. Грабаря в конце 2006 года.
В настоящее время в обители работает приют для девочек-сирот, благотворительная столовая и патронажная служба. Сёстры работают в военных госпиталях, НИИ «Скорой помощи» им. Н. В. Склифосовского.